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固氮菌肥料行业标准

(发布日期:2007-5-23 10:24:02)
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标准类别:NY-行业标准(农业)

  关键词:固氮菌肥料

  标准号:NY411—2000

  标准名称:固氮菌肥料*

  标准分类:农业土壤化肥标准

  颁布部门:

  颁布日期:

  实施日期:

  ========================================================

  1范围

  本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。

  本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气,供作物氮素营养,又能分泌激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。

  2引用标准

  下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均为有效。所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

  GB/T625—1989化学试剂硫酸

  GB/T629—1997化学试剂氢氧化钠

  GB/T1250—1989极限数值的表示方法和判定方法

  GB/T6543—1986瓦楞纸箱

  GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法

  3定义

  本标准采用下列定义。

  31自生固氮菌

  在土壤里能固定空气中的氮,供作物氮素营养,又能分泌激素刺激作物生长的微生物。

  32根际联合固氮菌

  既依赖根际环境生长,又在根际中固定空气中的氮气,对作物的生长发育产生积极作用的微生物。

  33固氮效能

  固氮菌每消耗1g碳水化合物(糖)从空气中摄取氮素的毫克数,固氮效能用mg氮/g糖表示。

  4产品分类

  41按剂型不同分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。

  42按菌种及特性分为自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。

  5技术要求

  51菌种

  在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮,并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状(固氮螺菌属菌体呈螺旋状),革兰氏染色阴性。

  511自生固氮菌

  用固氮菌属(Azotobacter)、氮单胞菌属(Azomonas)的菌种,也可用茎瘤根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)和固氮芽胞杆菌(Paenibacillusazotofixans)菌株。

  512根际联合固氮菌

  可用下列菌种固氮螺旋菌(Azospirillum);阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)经鉴定为非致病菌的菌株;粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)经鉴定为非致病菌的菌株;肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)经鉴定为非致病菌的菌株。

  使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时,菌种必须经过鉴定,并符合51要求。

  生产固氮微生物肥料所使用的菌种,必要时还要进行菌种染色鉴别(见附录B)和菌种固氮效能测定(见附录C)。

  52成品技术指标(见表1)

  表1成品技术指标

  指标剂型:液体固体冻干

  项目:乳白或淡褐色液体,黑褐色或褐色粉状,

  外观、气味混浊,稍有沉淀,无湿润、松散,无异臭乳白色结晶,无味

  异臭味味

  水分,%—250!35030

  pH值55!7060!7560!75

  细度,过孔径018mm标准筛5200

  的筛余物,%#

  有效活菌数,个/mL(个/g、个/501081010850108瓶)$

  杂菌率1),%$5015020

  有效期,2),月#3612

  1)其中包括10-6马丁培养基平板上无霉菌。

  2)此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。

  6抽样

  按每一发酵罐菌液制成的产品为一批,逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。

  61抽样工具及用品

  抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。

  62抽样数量及抽样方法

  在成品库抽样,可按''形分层设点抽取,抽样以件为单位,小包装产品以一包装箱为一件。大包装(30!50kg)产品以一袋(或一桶)为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。1!10件,全部抽样;11!200件,抽样10件;201!400件,抽取20件;样品基数大于

  400件者,按超过部分的2%增加抽样件数,但总件数不要超过40件。

  每件包装产品抽取一小袋,在无菌条件下每袋取样200g。然后将所有样品混匀,按四分法缩到2000g,分装4袋,然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。

  液体产品每件吸取10mL,一同放入无菌的三角瓶中,混匀后分成两份,每份250mL。冻干产品,每件取一支放入无菌的三角瓶中,加无菌液体培养液,溶解混匀后分成两份,每

  份50mL。贴上标签和封条(一份被抽样单位留存,一份交检测中心检测)。

  7检验方法

  71仪器设备及试剂

  711仪器设备

  生物显微镜(10100);菌落计数器;恒温培养箱;恒温干燥箱,恒温摇床;灭菌锅;无菌室或超净工作台;酸度计;试管%15mm150mm,%18mm180mm;培养皿直径9cm; 三角瓶500mL;无菌吸管05、1、5、10mL;玻璃刮刀;滤纸;酒精灯;标准筛孔径018mm和015mm;1号羊毛画笔;无菌水;无离子水。712试剂选择培养基(见附录A);刚果红染液(05%)。

  72成品检验

  721气味检验

  取固氮菌肥料样品打开包装,进行感观检验。

  722外观检验

  将固体固氮菌肥料包装打开,装在白色搪瓷盘中,将液体固氮菌肥料摇匀,在明亮光线下进行感观检验。

  723pH值测定

  液体固氮菌肥料的pH值测定:取供检菌液直接测定pH值,取三次测定结果的平均数。固体固氮菌肥料的pH值测定:取50mL烧杯一个,加入菌肥25g,无离子水25mL。通过磁力搅拌器使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

  724含水量测定

  称取固体固氮菌肥三份,每份2000g,精确到001g,放入已称恒重的铝盒中。置105干燥箱内烘烤4h,移至干燥器内,冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(1)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。

含水量(m

  %)=0-m1

  m100…………………………(1)

  0

  式中m0———烘干前样品质量,g;

  m1———烘干后样品质量,g。

  725吸附剂颗粒细度测定

  称样1000g

  (精确至001g),置于标准筛中(直径分别为018mm或015mm),用水冲洗,用毛笔轻刷,至粉末不再通过为止。将筛余物置105!110温度下烘干,称重。筛余物百分含量按式(2)计算:

  筛余物(%)=筛余物量(1-样品含水量百分数)

  样品质量100…………(2)

  726有效活菌数和杂菌含量测定

  采用平板计数法测定有效活菌数及杂菌率。

  7261测定步骤

  采样应不少于500g,从中称取1000g,加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取10mL,加入90mL的无菌水中),静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡

  30min,即成母液的菌悬液。

  用无菌吸管吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中,混匀成110稀释的菌悬液,这样依次稀释,分别得到11102,11103,11104,11105等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

  用05mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液01mL,加至直径为9cm平皿的选择培养基(见附录A)表面,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面,或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内,与琼脂培养基混匀,每个样品取3个连续适宜稀释度,每一稀释度重复3次,同时加无菌水的空白对照。28培养2!3d后每个稀释度取5!10个菌落的菌体,涂片染色(见附录B)。显微镜观察识别后,选一个适宜稀释度(菌落在30!300个之间的平板),计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。

  杂菌数是指在选择培养基上,除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样,操作步骤同样品有效活菌数检测操作。

  7262允许差

  平行样品误差按式(3)计算,并应符合表2的规定。

  *=%(x--x)

  (n-1…………………………………(3)

  式中*———单一标准差;

  x———同一个稀释度任一个平板测定值;

  -x———同一个稀释度平板测定的平均值;

  n———重复次数。

  表2平板上菌落数对应的单—标准差

  平板上菌落数,个/皿30!5051!99100!300

  单一标准差,100200500

  7263测定结果的计算

  按式(4)、式(5)计算样品的有效活菌数及杂菌率

  有效活菌数(个/g)=菌落平均数稀释倍数母液菌悬液的体积(mL)

  菌剂克数或毫升数

  1

  加样量(mL)……………………………………………………………………………(4)

  杂菌率(%)=杂菌数

  有效菌数+杂菌数100……………………(5)

  727有效期检验在产品说明书标明的有效期到达前10d测定扰品各项指标,方法同721!726。

  8检验规则

  81检验分类

  811产品出厂检验

  产品交货时进行的检验。

  812产品型式检验

  新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。

  82检验项目

  型式检验的检验项目按52要求进行。出厂检验不检有效期。

  83判定规则

  831合格产品:

  a)检验结果符合52所规定的技术指标的产品为合格产品;

  b)产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时(液体10%、固体30%、冻干瓶4%),而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30105,其他指标有一项不符合,也可判为合格产品;

  C产品有效活菌数及杂菌率符合指标,在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中,有3项不符合技术指标,也判为合格产品。

  832不合格产品

  a)产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出,判为不合格产品;

  b)产品杂菌率超过本标准规定的两倍(液体10%、固体30%、冻干瓶4%),判为不合格产品;

  c)产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时C液体10%、固体30%、冻干瓶4%),其他指标有两项不符合指标,判为不合格产品;

  d)产品检验在马丁培养基平板上霉菌数#30105,判为不合格产品;

  e)产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中,有4项不符合技术指标,判为不合格产品。

  833含有植物促生根际细菌(PGPR)的固氮菌肥料产品检测时,只测固氮菌数量,不测

  植物促生根际细菌的数量,也不视其为杂菌。

  834本标准中质量指标合格判断,采用GB/T1250中修约值比较。

  9包装、标识、运输和贮存

  91包装

  911内包装

  液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶,大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。

  912外包装

  外包装采用纸箱,纸箱质量应符合GB/T6543的要求。箱外用尼龙打包带加固。

  913每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书,在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。

  92标识

  在包装箱(袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重,并印有防晒、防潮、防冻等标记,若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。

  93运输

  适用于常用运输工具,运输过程中有遮盖物,防止雨淋、日晒及35以上高温。气温低于0时采取保温措施,防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸,避免包装破损。

  94贮存

  产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内,最适温度为10!25,不得露天堆放,以防雨淋和日晒,避免冻冰及长时间35以上高温。

  以上高温。

  附录A

  (标准的附录)

  有效活菌数和杂菌(霉菌)测定的选择培养基

  A1固氮菌用阿须贝氏(Ashby)培养基

  磷酸二氢钾(KH2PO4)02g

  硫酸镁(MgSO4·7H2O)02g

  氯化钠(NaCl)02g

  碳酸钙(CaCO3)50g

  甘露醇(CsH14O6)100g

  硫酸钙(CaSO4·2H2O)01g

  pH70

  A2固氮(茎瘤)根瘤菌培养基

  乳酸钠(C3H3O3Na)100g

  磷酸氢二钾(K2HPO4)167g

  磷酸二氢钾(KH2PO4)087g

  氯化钠(NaCl)005g

  氯化钙(CaCl2)004g

  氯化铁(FeCl3)0004g

  硫酸镁(MgSO4·7H2O)01g

  酵母膏10g

  (或酵母粉08g)

  pH68

  A3联合固氮菌培养基

  D-葡萄糖酸钠(C6H11O7Na)50g

  磷酸二氢钾(KH2PO4)04g

  磷酸氢二钾(K2HPO4)01g

  硫酸镁(MgSO4·7H2O)02g

  酵母膏10g

  (或酵母粉08g)

  氯化钠(NaCl)01g

  氯化钙(CaCl2)002g

  氯化铁(FeCl3)001g

  钼酸钠(Na2MoO4)0002g

  pH68!70

  A4马丁培养基(测霉菌数)

  磷酸氢二钾(K2HPO4)10g

  硫酸镁(MgSO4·7H2O)05g

  葡萄糖(C6H12O6·H2O)100g

  蛋白胨50g

  1%孟加拉红水溶液〔四氯四碘荧光素

  (C20H4ClI

  44O5)〕33mL

  每升培养基中加入01g氯霉素,一起灭菌。

  注以上各培养基需蒸馏水1000mL,琼脂18!20g

  附录B

  (标准的附录)

  染色剂和染色方法

  B1荚膜染色法

  B11染色剂

  石碳酸复红染色液

  甲液:碱性复红(Basicfuchsin)

  (C20H20ClN3)03g

  95%酒精(CH3CH2OH)100mL

  乙液:石碳酸(C6H5OH)50g

  蒸馏水950mL

  a)将碱性复红在研钵中研磨后,逐渐加入95%酒精,继续研磨使之溶解,配成甲液。

  b)将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。

  c)把甲液和乙液混合摇匀,成为石碳酸复红,通常可将混合液稀释5!10倍使用。

  稀释液易变质失效,一次不宜多配。

  B12染色方法

  B121取少量培养菌涂于载玻片水滴中,涂成薄层。

  B122自然干燥或稍加热。

  B123在石碳酸复红染1min后,水洗,干后镜检。

  B13染色结果

  菌体为红色,菌体周围有一层透明圈即为荚膜。

  B2芽胞染色法

  B21染色剂

  B2115%孔雀绿

  孔雀绿(C23H25ClN2)50g

  蒸馏水100mL

  B212005%碱性复红

  碱性复红(C20H20ClN3)05g

  95%酒精100mL

  B22染色方法

  B221制片。

  B222加孔雀绿染液3!5滴于涂片处,酒精灯火焰加热至冒汽,但不沸腾,并随时补加

  染液,维持涂片处不干,染色约5!10min。

  B223自来水冲洗30s。

  B224用005%碱性复红染色1min,水洗,镜检(若005%碱性复红浓度太高,可根据

  具体情况适当稀释)。

  B23染色结果

  芽胞绿色,菌体红色。

  B3革兰氏染色法

  B31染色剂

  B311结晶紫染色液

  甲液结晶紫(C25H30ClN3·9H2O)20g

  乙醇(95%)

  (CH3CH2OH)20mL

  乙液:草酸铵〔(NH4)2C2O4·H2O〕08g

  蒸馏水80mL

  甲、乙液相混,静置48h后使用。

  B312卢哥(Lugol)氏碘液

  碘(I2)片10g

  碘化钾(KI)20g

  蒸馏水300mL

  先用少量(3!5mL)蒸馏水溶解碘化钾,再投入碘片,待碘全溶后,加水100mL,配成母

  液,使用时加两倍水,稀释成卢哥氏碘液。

  B313脱色液:95%乙醇。

  B314复染液:05%的番红水溶液

  25%番红酒精溶液10mL

  蒸馏水100mL

  B32染色方法

  B321制片。

  B322滴加结晶紫液,覆盖1min。

  B323用水冲净结晶紫液。

  B324滴加碘液冲去残水,并覆盖1min。

  B325用水冲去碘液,用吸水纸吸去水分。

  B326加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,30s后水洗,吸去水分。

  B327番红染色液染10s后,自来水冲洗。干燥,镜检。

  B33染色结果

  革兰氏正反应菌体呈紫色,负反应菌体呈红色。

  B4鞭毛染色

  B41染色剂

  甲液:丹宁酸(C76H52O46)50g

  氯化铁(FeCl3)15g

  甲醛(15%)

  (HCHO)20mL

  氢氧化钠(NaOH)

  (1%)10mL

  蒸馏水100mL

  乙液:硝酸银(AgNO3)2g

  蒸馏水100mL

  待硝酸银溶解后,取出10mL备用,其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,则形成很浓厚的沉淀,再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴人,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,再滴入硝酸银,直到摇动后,仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止(如雾重,则银盐沉淀出,不宜使用)。

  B42染色方法

  421涂片:在载玻片的一端滴一滴蒸馏水,用接种环挑取斜面上少许菌苔,在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜,使菌液随水滴缓慢流到另一端,然后平放在空气中干燥B422涂片干燥后,滴加甲液染3!5min,用蒸馏水冲洗。加乙液染30!60s,并在酒精灯上加热,使其稍冒蒸气而染液不干,然后用蒸馏水冲洗,干后镜检。

  B43染色结果

  菌体为深褐色,鞭毛为褐色。

  附录C

  (标准的附录)

  菌种固氮效能测定方法

  在500mL三角瓶中加入100mL无氮培养基(含糖1%即1g),121灭菌30min。无菌操作,每瓶接入两环待测菌种(或1mL培养3d的培养液),放置摇床上振荡(120r/min)

  30培养5!7d后,取出定糖测氮。

  定糖采用蒽酮光电比色法。

  测氮采用半微量光电比色法。

  C1蒽酮光电比色法

  C11测定原理

  糖类遇硫酸即脱水成为醛类,再变成呋喃衍生物,后者与蒽酮缩合,生成蓝绿色化合物。于580!650nm处进行比色测定(蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应),该方法适

  合于含糖量0003%以上的样品。

  C12试剂和仪器

  分析中除有说明外,限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。

  C121硫酸。

  C12202%(m/V)蒽酮溶液:称取02g蒽酮于100mL硫酸中。充分搅拌,使其溶解。

  该溶液不稳定,应当天配用。

  C123葡萄糖标准液:准确称取葡萄糖1000g,溶于水中,定容至1000mL,即为

  1000mg/mL标准液。

  C124分光光度计。

  C13分析步骤

  C131试样处理

  取发酵培养的菌液100!400mL(取决于含糖量),稀释至10000ml,取此稀释液100mL于比色管中,加水至200mL,每管加入蒽酮试剂400mL,摇匀,水浴加热15min,使之充分显色,冷却后,于580!650nm处进行比色测定,记录吸光度,同时进行空白试验。

  C132标准曲线绘制

  吸取葡萄糖标准溶液100、200、400、600、800、1000、2000mL。于100mL容量瓶

  中,加水至刻度,该液分别含糖10、20、40、60、80、100、200%g/mL。

  吸取1.00mL放入比色管中,加水至2.00mL,按C1.3.1方法测定,记录吸光度用标准系列的含糖量定义横坐标,吸光度为纵坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

  C14分析结果的计算

  100mL溶液的含糖量(X)按式(C1)计算:

  X=(m1-m2)100

  m10010-6…………………………(1)

  式中:m1———标准曲线上查出的试验含糖量,%g/mL;

  m2———标准曲线上查出的空白试验的含糖量,%g/mL;

  m———吸取发酵溶液体积,mL。

  C15允许差

  a)取平行测定的算术平均值为测定结果;

  b)平行测定结果的允许差不大于0005g/100mL。

  C2固氮菌液全氮比色测定法

  C21测定原理

  在硫酸铜或硫酸钾存在下,浓硫酸中加入菌液,并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮,与奈氏试剂反应,于波长420nm处进行比色测定。

  C22试剂和仪器

  分析中除非另有说明,限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。

  C221硫酸(GB/T625)。
C222双氧水

  C223氢氧化钠(GB/T629)2mol/L溶液:称量8g氢氧化钠溶于水中,定容至100mL。

  C22440%(m/V)氢氧化钠(GB/T629)溶液:称取40g氢氧化钠溶于100mL。水中。

  C22550%(m/V)酒石酸钾钠溶液:50g酒石酸钾钠溶于100mL水中。

  C226奈氏试剂:71g碘化钾,10g碘化汞(HgI2)溶于少量水中,另配16g氢氧化钠溶于

  70mL水中,冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中,边加边搅拌,最后用水稀释至100mL,静置过夜,取清液储于棕色瓶中。

  C227催化剂:1000g硫酸钾与100g硫酸铜共同研磨均匀,储于广口瓶中。

  C228分光光度计。

  C23分析步骤

  C231试样制备和测试

  吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中,加硫酸(C221)3mL,加01g催化剂(C227)和5滴双氧水(C222)消煮至清亮,若反应液久煮不清,可冷却后加1!2滴双氧水(C222),继续煮至无色透明,取下冷却。加少许蒸馏水,摇匀,滴加40%氢氧化钠至出现氢氧化铜沉淀(约11!12mL),加酒石酸钾钠(C225)20滴,以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁,将试管液全部转移至100mL容量瓶中,消化管洗涤液一并倒入容量瓶,稀释至刻度,摇匀。过滤,滤液1000mL于比色管中,加氢氧化钠(C223)100mL,加酒石酸钾钠100mL,加奈氏试剂3mL,摇匀,显色2!3min后,即倒入比色杯中,于420nm处比色计测定。读取吸光度。

  C232标准曲线的绘制

  准确称取在(1055)烘1h直至恒重的优级纯试剂硫酸铵04716g,溶于水,稀释至

  100mL,该液含氮1mg/mL,取此液005、010、025、050、100、200mL。放入100mL容量瓶,用水稀释至刻度,其含氮分别为050、100、250、500、1000、2000/%g/mL,取标准液各1mL放入比色管中,加水至2mL,按C131方法测定,记录吸光度。

  用标准液的氮含量为横坐标,相应的吸光度为纵坐标,绘制工作曲线。

  C24分析结果的计算

  氮(X)含量以g/100mL表示,按式(C2)计算

  X=(m1-m2)1000

  m10010-6………………………(C2)

  式中m1———标准曲线上查出的试验含氮量,%g/mL;

  m2———标准曲线上查出的空白试验氮含量,%g/mL;

  m———吸取发酵溶液体积,mL。

  C25允许差

  a)取平行测定和算术平均值为测定结果;

  b)平行测定结果的允许差不大于0005g。

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